Hoá mô miễn dịch là gì? Các nghiên cứu khoa học liên quan

Giới thiệu chung

Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) là kỹ thuật sinh học kết hợp nguyên lý miễn dịch học và mô học nhằm xác định sự hiện diện, vị trí và mức độ biểu hiện của protein trong mô được xử lý và gắn trên lam kính. Kỹ thuật này sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện kháng nguyên đích, sau đó ghi nhận tín hiệu nhờ các hệ phát hiện như enzym hoặc fluorophore. Các nguồn khoa học như Nature và bộ hướng dẫn kỹ thuật của Thermo Fisher Scientific cung cấp dữ liệu chuẩn về nguyên lý và ứng dụng của IHC.

IHC trở thành công cụ thiết yếu trong bệnh học hiện đại vì cho phép đánh giá protein trong bối cảnh mô học, một yếu tố mà các kỹ thuật phân tử thuần túy không cung cấp. Khả năng xác định biểu hiện protein theo từng vùng mô giúp phân biệt chính xác các dạng tổn thương, đặc biệt trong ung thư học nơi mỗi marker phân tử phản ánh sự khác biệt về sinh học và tiên lượng. Bên cạnh vai trò lâm sàng, IHC còn được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu cơ bản để khảo sát cơ chế bệnh sinh, quá trình phát triển mô và phản ứng miễn dịch.

Dưới đây là một số đặc điểm nền tảng mô tả kỹ thuật IHC:

• Sử dụng kháng thể đặc hiệu nhằm nhận diện protein mục tiêu trong mô.
• Tín hiệu phát hiện tạo ra nhờ enzyme hoặc fluorophore.
• Cho phép phân tích protein trong bối cảnh cấu trúc mô học còn nguyên vẹn.

Nguyên lý kỹ thuật

Nguyên lý trung tâm của IHC là sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody). Kháng thể này có thể được gắn nhãn enzym như horseradish peroxidase (HRP) hoặc alkaline phosphatase (AP), cho phép tạo màu khi thêm cơ chất tương ứng. Ngoài enzym, fluorophore cũng được sử dụng để tạo tín hiệu huỳnh quang, giúp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang với độ phân giải cao. Mỗi hệ phát hiện có ưu điểm riêng, phụ thuộc vào loại mô, mức độ biểu hiện protein và yêu cầu phân tích.

Kháng thể có thể là kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng, được lựa chọn dựa trên độ đặc hiệu, khả năng gắn mạnh và độ ổn định trong điều kiện xử lý mô. Việc tối ưu hóa điều kiện nhuộm, bao gồm nồng độ kháng thể, thời gian ủ và nhiệt độ, có vai trò quan trọng nhằm giảm nhiễu nền và tăng độ tương phản tín hiệu. Các phòng thí nghiệm nghiên cứu thường xây dựng quy trình SOP nhằm chuẩn hóa từng bước của IHC.

Bảng dưới đây mô tả các thành phần chính tham gia vào một phản ứng IHC hoàn chỉnh:

Thành phần	Vai trò
Kháng thể sơ cấp	Nhận diện trực tiếp protein mục tiêu
Kháng thể thứ cấp	Gắn nhãn và khuếch đại tín hiệu
Hệ enzym hoặc fluorophore	Phát tín hiệu để quan sát
Cơ chất tạo màu	Tạo tín hiệu màu bền vững trên mô

Các phương pháp thực hiện

Có hai phương pháp nền tảng: IHC trực tiếp và IHC gián tiếp. Trong phương pháp trực tiếp, kháng thể sơ cấp được gắn nhãn sẵn, cho phép tín hiệu xuất hiện ngay khi kháng thể gắn vào kháng nguyên. Phương pháp này có độ đặc hiệu cao nhưng độ nhạy thấp hơn do không có bước khuếch đại. Trong khi đó, phương pháp gián tiếp sử dụng kháng thể thứ cấp gắn nhãn nhằm tăng cường tín hiệu, từ đó cho phép phát hiện protein có mức biểu hiện thấp.

Bên cạnh hai phương pháp cổ điển, các hệ thống phát hiện nâng cao như polymer-based detection hay streptavidin-biotin complex (trong một số bối cảnh cụ thể) được sử dụng để giảm nhiễu nền và tăng độ tương phản. Các bộ kit thương mại hiện đại đã đơn giản hóa quy trình, cho phép sử dụng trong cả phòng thí nghiệm nghiên cứu lẫn bệnh viện. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào đặc điểm kháng nguyên, chất lượng mô và yêu cầu phân tích.

Các phương pháp thường gặp bao gồm:

• Phương pháp trực tiếp (direct IHC).
• Phương pháp gián tiếp (indirect IHC).
• Hệ polymer tăng cường tín hiệu.
• Nhuộm huỳnh quang miễn dịch (immunofluorescence–IF).

Chuẩn bị mẫu mô

Mẫu mô dùng trong IHC thường là loại FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded), được cố định bằng formalin và đúc paraffin để bảo quản cấu trúc mô. Quy trình chuẩn bị mẫu bao gồm cố định, cắt tiêu bản, khử paraffin và hydrat hóa. Các bước này ảnh hưởng trực tiếp đến sự bảo tồn kháng nguyên; nếu cố định quá lâu, epitopes có thể bị che khuất hoặc biến tính, làm giảm khả năng nhận diện bởi kháng thể.

Để tăng khả năng nhận diện kháng nguyên, nhiều mục tiêu cần trải qua bước hồi phục kháng nguyên (epitope retrieval), có thể thực hiện bằng nhiệt (HIER – heat-induced epitope retrieval) hoặc enzyme (EIER – enzyme-induced epitope retrieval). Việc lựa chọn phương pháp hồi phục phụ thuộc loại protein, tính chất biểu mô và lịch sử mô. Các tiêu bản đông lạnh cũng được sử dụng trong một số trường hợp cần bảo tồn cấu trúc protein nhạy cảm với nhiệt.

Bảng dưới đây trình bày các phương pháp hồi phục kháng nguyên phổ biến:

Phương pháp	Cơ chế
HIER	Dùng nhiệt phá liên kết methylene tạo bởi formalin
EIER	Sử dụng enzyme phân giải protein che khuất epitope
Không hồi phục	Dành cho các kháng nguyên bền khi cố định bằng formalin

Ứng dụng trong sinh học và y học

IHC được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học nhằm xác định sự phân bố không gian của protein trong các giai đoạn phát triển mô, bệnh lý hoặc đáp ứng miễn dịch. Việc quan sát protein ngay trong cấu trúc mô cho phép các nhà khoa học đánh giá mức độ biểu hiện theo từng loại tế bào, từ đó hiểu rõ hơn cách tế bào tương tác trong môi trường vi mô. Phân tích này đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào, viêm, tổn thương mô và sự thay đổi protein trong mô bị bệnh.

Trong y học lâm sàng, IHC là kỹ thuật trung tâm của chẩn đoán mô bệnh học. Các marker ung thư như HER2, Ki-67, ER, PR, p53 được sử dụng để phân loại khối u, đánh giá tiên lượng và lựa chọn phác đồ điều trị. IHC cũng góp phần phân biệt các loại ung thư có nguồn gốc mô khác nhau, ví dụ như phân biệt carcinoma, lymphoma và sarcoma bằng bộ marker tương ứng. Nhờ khả năng cung cấp thông tin phân tử kết hợp với mô học, IHC trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh lý hiện đại.

Một số ứng dụng tiêu biểu của IHC:

• Phân loại mô học và chẩn đoán ung thư.
• Đánh giá mức độ tăng sinh tế bào bằng Ki-67.
• Xác định nguồn gốc tế bào ung thư trong các trường hợp di căn.
• Khảo sát thay đổi protein trong mô nghiên cứu.

Phân tích và định lượng tín hiệu

Sau khi hoàn tất nhuộm IHC, tín hiệu được quan sát dưới kính hiển vi quang học hoặc hệ thống chụp ảnh kỹ thuật số. Các mô hình phân tích truyền thống dựa trên mắt người để đánh giá mức độ nhuộm theo thang điểm như 0, 1+, 2+, 3+. Tuy vậy, phương pháp này dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố chủ quan. Vì vậy, nhiều phòng thí nghiệm sử dụng hệ thống phân tích hình ảnh tự động nhằm tăng độ chính xác và tái lập kết quả, đặc biệt trong các xét nghiệm đánh giá đáp ứng điều trị.

Một số mô hình định lượng có thể sử dụng công thức tổng hợp nhằm đo lường mức độ biểu hiện protein. Ví dụ, điểm số tổng hợp có thể tính như sau:

$S = \sum_{i=1}^{n} I_i \cdot A_i$

Trong công thức này, $I_i$ là cường độ nhuộm của vùng thứ $i$ và $A_i$ là diện tích biểu hiện tương ứng. Công thức này giúp tạo ra giá trị định lượng thể hiện mức độ biểu hiện toàn mô, hỗ trợ phân tích so sánh giữa các nhóm nghiên cứu hoặc các mẫu bệnh phẩm khác nhau. Một số phần mềm chuyên dụng như ImageJ, QuPath hay HALO hỗ trợ phân tích nâng cao với độ chính xác cao hơn.

Bảng dưới đây mô tả các phương pháp đánh giá phổ biến:

Phương pháp	Mô tả
Bán định lượng	Dựa trên thang điểm trực quan 0–3+
Định lượng qua phần mềm	Sử dụng thuật toán để tính diện tích và cường độ tín hiệu
Điểm tổng hợp	Kết hợp cường độ và diện tích biểu hiện

Ưu điểm và hạn chế

IHC có nhiều ưu điểm quan trọng, trong đó nổi bật nhất là khả năng xác định protein trong bối cảnh mô học, điều mà nhiều kỹ thuật phân tử không thể cung cấp. Tính đặc hiệu cao nhờ kháng thể đặc hiệu giúp nhận diện chính xác target protein, trong khi hệ phát hiện enzym tạo tín hiệu ổn định có thể lưu giữ lâu dài trên lam kính. Kỹ thuật này tương thích với hầu hết các loại mô FFPE, vốn là tiêu chuẩn trong bệnh học.

Tuy nhiên, IHC cũng có những hạn chế nhất định. Kết quả phụ thuộc mạnh vào chất lượng kháng thể, điều kiện xử lý mẫu và quy trình hồi phục kháng nguyên. Nếu quá trình cố định mô không chuẩn, cấu trúc epitope có thể bị biến tính, gây giảm độ đặc hiệu hoặc tạo nhiễu nền. Các vấn đề như gắn chéo không đặc hiệu, tự nhuộm mô và biến đổi cơ chất cũng có thể ảnh hưởng đến độ tin cậy của kết quả.

Bảng tổng hợp dưới đây nêu các điểm mạnh và điểm yếu của IHC:

Ưu điểm	Hạn chế
Quan sát protein ngay trong mô	Phụ thuộc chất lượng kháng thể
Độ đặc hiệu cao	Nguy cơ nhiễu nền
Dùng cho chẩn đoán lâm sàng	Biến thiên giữa các phòng thí nghiệm

Các biến thể kỹ thuật

Hóa mô miễn dịch có nhiều biến thể đáp ứng các mục tiêu nghiên cứu khác nhau. Immunofluorescence (IF) sử dụng fluorophore để tạo tín hiệu huỳnh quang, phù hợp cho phân tích đồng thời nhiều protein. Multiplex IHC, một phiên bản nâng cao, cho phép đánh dấu nhiều marker trên cùng một lam bằng các fluorophore hoặc hệ thống enzyme đặc biệt. Điều này hữu ích khi phân tích vi môi trường khối u, nơi cần hiểu rõ sự tương tác giữa nhiều loại tế bào.

Bên cạnh đó, công nghệ whole slide imaging cho phép số hóa toàn bộ lam kính, hỗ trợ phân tích tự động và lưu trữ dữ liệu lâu dài. Một số hệ thống thậm chí kết hợp trí tuệ nhân tạo để xác định mô hình biểu hiện protein với độ chính xác cao hơn. Các biến thể này mở rộng khả năng ứng dụng IHC trong nhiều lĩnh vực của nghiên cứu y sinh.

Các biến thể kỹ thuật phổ biến:

• Immunofluorescence (IF).
• Multiplex IHC.
• Chromogenic IHC truyền thống.
• Whole slide imaging hỗ trợ AI.

Vai trò trong y học cá thể hóa

IHC đóng vai trò quan trọng trong y học cá thể hóa, nơi điều trị được xây dựng dựa trên đặc điểm phân tử của từng bệnh nhân. Các marker protein được nhuộm bằng IHC hỗ trợ phân loại khối u theo đặc tính sinh học, từ đó lựa chọn liệu pháp nhắm trúng đích phù hợp. Ví dụ, xét nghiệm HER2 là yếu tố bắt buộc trước khi dùng trastuzumab điều trị ung thư vú.

Sự kết hợp giữa IHC và dữ liệu di truyền cho phép dự đoán đáp ứng điều trị tốt hơn. Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc tích hợp nhiều loại dữ liệu – protein, RNA, đột biến gene – nhằm xây dựng mô hình tiên lượng toàn diện. Đây là hướng phát triển cốt lõi của y học chính xác.

Kết luận

Hóa mô miễn dịch là kỹ thuật quan trọng của khoa học sự sống và y học hiện đại, giúp xác định biểu hiện protein trong mô với độ chính xác cao. Sự phát triển của công nghệ phát hiện, phân tích hình ảnh và tự động hóa đã nâng cao đáng kể độ tin cậy và mở rộng ứng dụng của IHC. Việc hiểu rõ nguyên lý, ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật là nền tảng cho nghiên cứu và chẩn đoán bệnh lý chính xác.

Tài liệu tham khảo

• Nature – Immunohistochemistry Resources
• Thermo Fisher Scientific – IHC Protocols
• National Cancer Institute – Cancer Diagnostics
• Các bài báo chuyên ngành miễn dịch học và mô bệnh học đăng trên các tạp chí quốc tế.